基于Edman降解的蛋白质N端测序

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北京百泰派克生物科技有限公司

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蛋白质组学鉴定服务，代谢组学服务，蛋白质测序服务等

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生物检测多肽合成服务代谢组学服务生物制药分析流式多因子检测从头测序蛋白质组学服务

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产品品牌：百泰派克

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表达纯化后的蛋白产物，特别是蛋白品的分析过程中，需要对蛋白的末端进行验证，以保证表达纯化产物的N端和C端序列准确。Edman降解法是蛋白的N端序列分析中非常成熟的方法之一，有着广泛的应用。

百泰派克公司采用岛津公司 edman测序系统，为广大科研工作者和科研客户提供纯化后蛋白产物、抗体以及蛋白疫苗的N端测序服务。采用我们的测序系统，可以测定N端30个氨基酸的序列信息。采用特定的蛋白上样系统，可以测定N端的60-70个氨基酸。百泰派克公司也建立了以先进的LC-MS/MS技术进行N-端测序的平台，可以测出封闭和修饰的蛋白质末端，与Edman降解法形成互补，保证N端测序服务的顺利进行。在蛋白质测序前，蛋白样品首先经过SDS-PAGE的分离，保证样品的纯度满足测序的要求；随后将SDS-PAGE上的蛋白样品转移到PVDF膜上；经过染色确定把蛋白条带并切出；使用Edman测序仪对得到的PVDF膜上的蛋白样品进行分析。Edman降解测序是通过循环反应从蛋白质的N端开始逐个鉴定氨基酸的种类，从而对蛋白质的N端序列进行测定。每一个Edman测序反应包括3步：一步是在碱性条件下，PITC与蛋白N端的游离氨基结合；第二步是在酸性溶液中，N端残基被切除；第三步是PITC结合的残基转化成为更为稳定的PTH残基，经过在线的HPLC分析，根据洗脱时间确定氨基酸种类。

应用领域

• 蛋白表达产物的验证：重组蛋白插入位点和表达顺序是否正确 • 细胞株建立和发酵过程中蛋白产物的验证：验证细胞株建立和发酵过程中蛋白产物N端甲硫氨酸和信号肽是否正确处理； • 蛋白降解/酶切分析：对降解/酶切形成的新蛋白片段N端进行分析，确定断裂/酶切位点； • De-novo测序：对于蛋白数据库中不存在的全新蛋白序列进行分析。

关于样品

PVDF膜类样品的准备过程 1.样品电泳和电转 a. 对蛋白样品进行1D或者2D跑胶 b. 将蛋白胶上的样品转移至PVDF膜上；注意：千万不要使用硝酸纤维素膜（Nitrocellulose membranes） c. 在此过程中请佩戴手套和头套，避免自身角蛋白对测序结果的影响 2.PVDF膜的染色 a. 染色过程中可以使用考马斯亮蓝或者立春红对PVDF膜进行染色；注意：千万不要使用银染的方法进行染色 b. 染色完成之后，可以使用双蒸水对PVDF膜进行清洗 c. 如果转膜的缓冲液中含有甘氨酸，需要对PVDF膜进行多次冲洗，以避免甘氨酸对后续分析的影响 d. 更详细的样品准备步骤，见Edman测序样品准备Protocol 3.靶蛋白条带获取 a. PVDF膜染色后，靶条带清晰可见，用洁净的解剖刀将靶蛋白条带切下 b. 在蛋白量允许的情况下，可以准备2-3条靶条带以增加靶蛋白的量 4.样品运输对切下的蛋白条带进行密闭包装，使用冰袋运输即可 溶液样品的准备过程 1.蛋白的纯度和用量 a. 样品需要量在1-10ug b. 样品纯度要＞90% c. Buffer中不要使用表面活性剂，并尽可能降低溶液的盐浓度 d. Tris, glycine, guanidine, glycerol, sucrose, ethanolamine, SDS, Triton, X-100, Tween和其他的去垢剂, ammonium sulfate 和其他的铵盐均会对后续的氨基酸鉴定产生影响，在样品准备过程中要避免使用 e. 样品准备过程全程佩戴口罩和头套，避免角蛋白的影响 2.蛋白样品的运输 a. 液体样品推荐干冰运输 b. 液体样品也可以在冷冻抽干或者真空抽干后，使用冰袋运输

中/英文项目报告

在技术报告中，百泰派克会为您提供详细的中英文双语版技术报告，报告包括： 1. 实验步骤（中英文） 2. 相关的质谱参数（中英文） 3. 蛋白质N端测序的详细信息 4. 质谱图片 5. 原始数据

百泰派克生物【biotech-pack.com】

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