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Cy5.5单琥珀酰亚基酯 Cy5.5 NHS酯背景：
多种花青 5.5 (Cy5.5®) 染料已用于标记生物分子，用于荧光成像和其他基于荧光的生化分析。它们广泛用于标记肽、蛋白质和寡核苷酸等。Cy5.5® 染料是最常见的红色荧光团之一。Cy5.5® NHS 酯很容易与氨基反应。AAT Bioquest 提供三乙铵盐形式的 Cy 染料 NHS 酯，与其他一些供应商提供的相应钾盐相比，它们更易溶于 DMSO 和 DMF。Cy 染料三乙基铵盐具有相同的反应性，并得到与 Cy 染料钾盐相同的缀合物。Cy5.5® 是 GE Healthcare 的商标。
1. 蛋白质原液（溶液 A）
将 100 µL 反应缓冲液（例如，1 M 碳酸钠溶液或 1 M 磷酸盐缓冲液，pH ~9.0）与 900 µL 目标蛋白溶液（例如抗体，如果可能，蛋白浓度 >2 mg/mL）混合，得到 1 mL 蛋白质标记原液。注意：蛋白质溶液（溶液 A）的 pH 值应为 8.5 ± 0.5。如果蛋白质溶液的 pH 值低于 8.0，则使用 1 M 碳酸氢钠溶液或 1 M pH 9.0 磷酸盐缓冲液将 pH 值调节到 8.0-9.0 的范围内。笔记：蛋白质应溶解在 1X 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)，pH 7.2-7.4。如果蛋白质溶解在 Tris 或甘氨酸缓冲液中，则必须对 1X PBS，pH 7.2-7.4 进行透析，以去除广泛用于蛋白质沉淀的游离胺或铵盐（如硫酸铵和乙酸铵）。注意：不纯的抗体或用牛血清白蛋白 (BSA) 或明胶稳定的抗体不会被很好地标记。叠丨氮化钠或硫柳汞的存在也可能干扰偶联反应。叠氮化钠或硫柳汞可以通过透析或离心柱去除以获得最佳标记结果。笔记：如果蛋白质浓度低于 2 mg/mL，偶联效率会显着降低。为获得最佳标记效率，建议使用 2-10 mg/mL 的最终蛋白质浓度范围。
2. 花青 5.5 单琥珀酰亚胺酯原液（溶液 B）
将无水 DMSO 添加到花青 5.5 单琥珀酰亚胺酯的小瓶中，制成 10 mM 库存溶液。通过移液或涡旋充分混合。注意：在开始偶联之前准备染料储备溶液（溶液 B）。及时使用。染料储备溶液的长期储存可能会降低染料活性。溶液 B 在避光和防潮的情况下可在冰箱中保存两周。避免冻融循环。
艾美捷Cy5.5单琥珀酰亚基酯 Cy5.5 NHS酯示例实验协议：
该标记方案是为山羊抗小鼠 IgG 与花青 5.5 单琥珀酰亚胺酯的偶联物而开发的。您可能需要进一步优化您的特定蛋白质。注意：每种蛋白质都需要不同的染料/蛋白质比例，这也取决于染料的性质。蛋白质的过度标记可能对其结合亲和力产生不利影响，而低染料/蛋白质比率的蛋白质缀合物会降低灵敏度。
艾美捷Cy5.5单琥珀酰亚基酯 Cy5.5 NHS酯运行偶联反应：
使用溶液 B（染料）/溶液 A（蛋白质）的 10:1 摩尔比作为起点：将 5 µL 染料储备溶液（溶液 B，假设染料储备溶液为 10 mM）添加到蛋白质小瓶中溶液（95 µL 溶液 A），有效摇动。假设蛋白质浓度为 10 mg/mL 且蛋白质的分子量为 ~200KD，则蛋白质的浓度为 ~0.05 mM。注意：我们建议使用溶液 B（染料）/溶液 A（蛋白质）的 10:1 摩尔比。如果太少或太高，分别确定J佳染料/蛋白质比例为 5:1、15:1 和 20:1。
在室温下继续旋转或摇动反应混合物 30-60 分钟。
以下方案是使用 Sephadex G-25 柱纯化染料-蛋白质偶联物的示例：
1.根据制造说明制备 Sephadex G-25 色谱柱。
2.将反应混合物（从“运行共轭反应”）加载到 Sephadex G-25 柱的顶部。
3.一旦样品在顶部树脂表面下方运行，立即添加 PBS (pH 7.2-7.4)。
4.向所需样品中添加更多 PBS (pH 7.2-7.4) 以完成色谱柱纯化。将含有所需染料-蛋白质结合物的部分结合起来。注意：为了立即使用，染料-蛋白质偶联物需要用染色缓冲液稀释，并分装以供多次使用。注意：为了长期储存，染料-蛋白质偶联物溶液需要浓缩或冷冻干燥。
